Cooperative antitumor effect of endothelial-monocyte activating polypeptide II and flutamide on human prostate cancer xenografts

Recombinant cytokine-like endothelial monocyte-activating polypeptide II (EMAP II) and antiandrogen flutamide target different mechanisms of growth of androgen-dependent prostate cancer (PC). The aim of this study was to clarify whether combined treatment with EMAP II and flutamide is more effective than monotherapy with regard to retardation of PC progression. Materials and Methods: Antitumor effects of EMAP II (10 µg/kg b.w./d, s.c., 3d), or flutamide (10 mg/kg b.w./d, per os, 3d), or their combination were studied in CBA male mice bearing human androgen-dependent PC xenografts for 7 days. Androgen-dependent phenotype of the tumors was verified in preliminary castrated mice. The xenografts were weighed and underwent a histopathologic examination. The results were compared with those of non-treated mice. Results: EMAP II and flutamide used separately inhibited growth of the xenografts by 74% and 53% respectively. Both drugs caused destructive changes in malignant epithelial cells along with leukocyte infiltration of the tumor. Combined treatment inhibited tumor growth by 85%, and was more effective than monotherapy with regard to morphological changes. Conclusions: This study demonstrates cooperative inhibitory effect of EMAP II and flutamide on growth and morphology of human PC xenografts that could represent a new modality of palliative treatment of this disease

СУЧАСНІ КОМП’ЮТЕРНІ ГРІД - ТЕХНОЛОГІЇ ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ В МЕДИЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

Issues of developing and applying of the newest perspective information direction – Grid-technology in medicine andbiology are considered. Its major feature is an opportunity of opening the way of transforming a global network of computersinto an integral practically unlimited computing resource which can have a crucial importance for development of medicineand biology.Grid is also defined as an universal infrastructure uniting computers common territorial – distributing system.The time leader on Grid creation networks in the world is the USA where since 2004, a strategic Grid – Program directedto the creation of integral national space for high-power calculations.In Europe since April, 2004 a big project ENABLING GRIDS FOR E-SCIENCE within the framework of which the all-European infrastructure based on Grid – technologies has been carrying out.Biomedicine is one of the directions, chosen in Europe for developing and implementing Grid – technologies. First of all,it concerns problems of creating databases of patient’s hereditary diseases. On the other hand, biomedical Grids are createdfor drawing up databases of various clinics with the purpose of creating a virtual hospital.Grid – medicine is a Grid infrastructure containing a specialized computer service, adapted for problems of processingbiomedical data. Accordingly, resources in Grid – medicine are computer resources, specialized bases of medical data,specialized medical devices and complexes.The first applicationsof Grid – technologies have shown the importance of Grid-computing paradigm for genomes researchesand processing of medical images, in particular in such areas as oncology, neurosurgery, radiotherapy.The key concept of Grid – technologies is creating a virtual organization – a group the users distributed territorially havingcommon aim and which will share their resources.Some examples of the created virtual laboratories and projects in area Grid – medicine are considered:Area 1. Medical graph and images processing.Area 2. Modeling a patient’s body for choosing treatment tactics and surgical intervention.Area 3. Grid – technologies in pharmacy.Area 4. Grid in genome to medicine.Area 5. Virtual biomedical universities and electronic training.For the first time a Program of information of the National Academy of Sciences within the framework of which a UkrainianNational Grid has been realized in Ukraine since 2005.In 2007, under the initiative of the Ministry of Education and Science of Ukraine National Grid– infrastructures for maintenanceof scientific researches and educations were created in Ukraine.The use of the firstly created Grid segment of the National Academy of Sciences and in perspective a national network willgive an opportunity to successfully integrate into the international scientific projects which are carried out in Europe and inother world centers of science. Undoubtedly, the development Grid – technologies and their implementation into practicalpublic health services, scientific researches and educational process will allow one to lead the level of training medicalstudents and medical specialists to the level of the best world standards.Рассмотрены вопросы разработ и и применения в медицине и биоло ии новейше о перспе тивно о информа-ционно о направления – Грид – техноло ии. Важнейшей ее чертой является возможность от рытия п ти преоб-разованию лобальной сети омпьютеров в единый, пра тичес и нео раниченный вычислительный омпьютер-ный рес рс, оторый может иметь решающее значение для развития медицины и биоло ии.Грид та же определяют а ниверсальн ю инфрастр т р , объединяющ ю омпьютеры и с пер омпьютеры водн общ ю территориально – распределенн ю систем .Без словным лидером по созданию Грид – сетей в мире являются США, де с 2004 ода реализ ется страте ичес аяГрид – про рамма, направленная на создание едино о национально о пространства для высо омощных вычислений.В Европе с апреля 2004 ода ос ществляется большой прое т ENABLING GRIDS FOR E-SCIENCE, в рам ах оторо-о создается общеевропейс ая инфрастр т ра, базир ющаяся на Грид-техноло иях.Биомедицина – одно из направлений, выбранное в Европе для разработ и и внедрения Грид-техноло ий. Вперв ю очередь это асается проблем создания баз данных наследственных заболеваний пациентов. С др ойстороны, биомедицинс ие Гриды создаются для составления баз данных различных лини с целью созданиявирт ально о оспиталя.Грид-медицина – это инфрастр т ра Грида, содержащая специализированный омпьютерный сервис, адапти-рованный для проблем обработ и биомедицинс их данных. Соответственно, рес рсами в Грид – медицине явля-ются омпьютерные рес рсы, специализированные базы медицинс их данных, специализированные медицинс-ие приборы и омпле сы.Уже первые применения Грид-техноло ий продемонстрировали важность паради мы Грид- омпьютин а для е-номних исследований и обработ и медицинс их изображений, в частности в та их областях, а он оло ия, ней-рохир р ия, радиотерапия.Ключевой онцепцией Грид-техноло ии является создание вирт альной ор анизации – р ппы распределенныхтерриториально пользователей, имеющих общ ю цель и оторые б д т делиться своими рес рсами.Рассмотрены не оторые примеры созданных вирт альных лабораторий и прое тов в области Грид – медицины:Область 1. Медицинс ая рафи а и обработ а изображений.Область 2. Моделирование тела пациента для выбора та ти и лечения и хир р ичес о о вмешательства.Область 3. Грид-техноло ии в фармации.Область 4. Грид в еномной медицине.Область 5. Вирт альные биомедицинс ие ниверситеты и эле тронное об чение.В У раине с 2005 ода выполняется про рамма информатизации Национальной а адемии на , в рам ах оторойвпервые создан У раинс ий национальный Грид.По инициативе Министерства образования и на и У раины в 2007 од объявлено о начале работ по созданиюобщенациональной Грид – инфрастр т ры для обеспечения на чных исследований и образования в У раине.Использование же созданно о перво о Грид-се мента Национальной а адемии на и в перспе тиве общенацио-нальной сети предоставит возможность спешно инте рироваться в межд народные на чные прое ты, оторые вы-полняются в Европе и в др их мировых на чных центрах. Несомненно, что развитие Грид – техноло ий и их внедре-ние в пра тичес ое здравоохранение, на чные исследования и образовательный процесс, позволит вывести ровеньпод отов и ст дентов-меди ов и медицинс их специалистов на ровень наил чших мировых стандартов.Розглянуті питання розробки та застосування в медицині та біології новітнього перспективного інформаційного напрямку – Грід-технології. Найважливішою рисою цієї технології є можливість відкриття  шляху до перетворення глобальної мережі комп’ютерів в єдиний, практично необмежений обчислювальний комп’ютерний ресурс, що може мати вирішальне значення для розвитку медицини і біології

Flexible 3D structure of Bos taurus tyrosyl-tRNA synthetase suggests the existence of the hinge mechanism provided by conservative Gly353 at interdomain linker

Mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is composed of two structural modules: N-terminal catalytic miniTyrRS and non-catalytic cytokine-like C-terminal module connected by a flexible peptide linker. Till now, the 3D structure of any full-length mammalian TyrRS has not been solved by X-ray crystallography. The aim of this work was a homology modeling of 3D structure of full-lehgth B. taurus tyrosyl-tRNA synthetase. Methods. Homology modeling of TyrRS was performed by Modeller 9.1 package. Quality of the models was assessed using Biotech Validation Suite web-server. Results. Our BLAST search identified 34 % sequence homology between interdomain linker of TyrRS and linker of human c-Abl tyrosine kinase. In order to model the full-length TyrRS structure we assembled the models of three parts of the protein (N- and C- terminal domains and the linker) using Modeller 9.1 software. The best Abl-17 model structure was refined by energy minimization. Conclusions. High flexibility of the interdomain linker can generate multiple conformations of TyrRS. The hinge mechanism at interdomain linker may be provided by conservative Gly353. It is proposed, that due to the linker flexibility an open extended conformation of TyrRS could transform into closed conformations in the enzyme-substrate complexes.Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) ссавців складається з двох структурних модулів: N-кінцевого каталітичного модуля (mini TyrRS) і некаталітичного цитокін-подібного C-кінцевого модуля, з’єднаних гнучким пептидним лінкером. До сьогодні просторову структуру повнорозмірної TyrRS ссавців не вирішено методом рентгенівської кристалографії. Мета цієї роботи полягала в моделюванні за гомологією просторової структури повнорозмірної TyrRS B. taurus. Методи. Моделювання за гомологією TyrRS проведено з використанням Modeller 9.1. Якість моделей оцінювали за допомогою Biotech Validation Suite web-сервера. Результати. За даними BLAST-пошуку визначено 34 %-ву гомологію послідовності міждоменного лінкера TyrRS і лінкера c-Abl тирозинкінази людини. Для моделювання структури повнорозмірної TyrRS ми зібрали модель з трьох фрагментів білка (N-і С-кінцевих доменів і міждоменного лінкера), використовуючи Modeller 9.1. Кращу модель структури Abl-17 уточнено методом мінімізації енергії. Висновки. Висока гнучкість міждоменного лінкера може призводити до формування множинних конформацій TyrRS. Шарнірний механізм у міждоменному лінкері, вірогідно, забезпечується консервативним залишком Gly353. Передбачається, що завдяки високій гнучкості міждоменного лінкера відкрита конформація TyrRS може переходити в закриту конформацію у ферментно-субстратних комплексах.Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) млекопитающих состоит из двух структурных модулей: N-концевого каталитического модуля (miniTyrRS) и некаталитического цитокин-подобного C-концевого модуля, соединенных гибким пептидным линкером. До настоящего времени пространственная структура полноразмерной TyrRS млекопитающих не решена методом рентгеновской кристаллографии. Цель данной работы состояла в моделировании по гомологии пространственной структуры полноразмерной TyrRS B. taurus. Методы. Моделирование по гомологии TyrRS выполнено с помощью пакета Modeller 9.1. Качество моделей оценивали с помощью Biotech Validation Suite web-сервера. Результаты. По данным BLAST-поиска определена 34 %-я гомология последовательности междоменного линкера TyrRS и линкера c-Abl тирозинкиназы человека. Для моделирования структуры полноразмерной TyrRS, мы собрали модель из трех фрагментов белка (N- и С-концевых доменов и междоменного линкера), используя Modeller 9.1. Лучшая модель структуры Abl-17 уточнена методом минимизации энергии. Выводы. Высокая гибкость междоменного линкера может приводить к формированию множественных конформаций TyrRS. Шарнирный механизм в междоменном линкере, вероятно, обеспечивается консервативным остатком Gly 353. Предполагается, что из-за высокой гибкости междоменного линкера открытая конформация TyrRS может переходить в закрытую конформацию в ферментно-субстратных комплексах

Virtual organizations internal structure projection methods for grid-infrastructures

Проведено аналіз особливостей внутрішньої структури віртуальних організацій (ВО) та показано їх вплив на ефективне планування ресурсів провайдером грід-інфраструктури. Досліджено методи виділення ресурсів Nordugrid ARC та сформовано методики розмежування доступу за параметрами участі у ВО. Відповідно до методик розроблено програмне забезпечення, яке успішно впроваджено на трьох кластерах українського національного грід (УНГ).Virtual Organizations (VOs) have an internal structure that was not driven by grid-infrastructure. The structure of the VO is influenced by many factors including number of members, resource usage, grid services usage and moreover social cooperation of researchers. Similarly to ordinary organizations that are usually divided into departments, hierarchical structure is also defined for the VOs. Generally, three parameters are used to describe VO structure: groups, roles and attributes. Grid-infrastructure resource provider's scheduler efficiency relies on VO internal structure recognition. Internal structure development process starts with VO particularity analysis. Virtual laboratory MolDynGrid that was established to conduct researches in structural biology and bioinformatics has been chosen as an example to demonstrate such analysis. Different requirements for several laboratory researches (molecular dynamics simulations using GROMACS software, molecular structure modeling using Modeller software, docking using AutoDock software) were described. Production versus testing computation properties were discussed. Based on performed analysis an internal structure for MolDynGrid VO has been settled. Methods of resource allocation employed by Nordugrid ARC were investigated. Necessity of binding different tasks to distinct queues of local resource management system has been shown. Lack of mechanisms for VO internal structure mapping to scheduler queues was pointed out. Analysis of the job processing algorithm in Nordugrid ARC computing element (A-REX) has shown that per-queue access control based on VO internal structure defined via Virtual Organization Membership Service (VOMS) attributes can be implemented as plug-in called out of A-REX when job gets moved to ACCEPTED state. Access separation algorithm has been developed and implemented in software. Plug-in introduces additional configuration options in Nordugrid ARC common configuration file that allow to specify access policy in terms of Fully Qualified Attribute Names (FQAN) representing internal structure developed for a VO. Software implementation of the methods presented has been successfully deployed on three Ukrainian National Grid clusters: Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, Taras Shevchenko National University of Kyiv, National Scientific Centre for Medical and Biotechnical Research at the Presidium of NAS of Ukraine. Example of plug-in configuration considering particularities of Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine cluster has been shown. Methods are applicable to the other grid-enabled clusters

Homology modeling of structure of NH₂-terminal module of mammalian (Bos taurus) tyrosyl-tRNA synthetase

Mammalian tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) is composed of two structural modules: the NH2-terminal catalytic core and cytokine-like COOH-terminal module. In order to elucidate the structural bases for the N-module functions we have used the computational prediction of its three-dimensional (3D) structure by comparative modeling approach. A model of the bovine TyrRS N-module represents the Rossmann nucleotide-binding fold (RF) which is linked to the α-helical domain (αHD). The RF domain forms a single β-sheet containing 5 parallel and one attached antiparallel β-strands surrounded by α-helices. The connective polypeptide, CP1, inserted between β3- and β4-strands of the RF domain is perturbed from the domain core. Comparative analysis of this multiple sequence alignment of known TyrRSs and the obtained model structure reveals the conservative surface elements, which could potentially form the tRNATyr-binding surface. This putative surface includes some exposed amino acid residues of CP1, e. g. essential Lys146 and Lys147 residues, which were identified earlier by site-directed mutagenesis.Тирозил-тРНК синтетаза ссавців (TyrRS) складається з двох структурних модулів: каталітичного NH2-кінцевого кора та цитокінподібного COOH-кінцевого модуля. Для вивчення структурних основ функціонування каталітичного N-модуля Здійснено комп' ютерне моделювання його просторової (3D) структури. Модель структури N-модуля TyrRS являє собою нуклеотидзв'язуючий фолд – згортку Россмана (RF), до якого приєднаний α-спіральний домен (αHD). RF-домен формує β-згортку, яка містить п'ять паралельних та один антипаралельний β-стренди, оточені α-спіралями. З'єднувальний поліпептид, CPі, розміщений між β3- та β4-стрендами RF-домену. Аналіз моделі виявив консервативні елементи, які можуть формувати область зв'язування гомологічної tRNATyr Ця область містить деякі амінокислотні залишки CP1, наприклад, функціонально важливі Lys146 та Lys147, які були ідентифіковані раніиіе методом сайт-спрямованого мутагенезу.Тирозил-тРНК синтетаза млекопитающих (TyrRS) состоит из двух структурных модулей: каталитического NH2-концевого кора и цитокинподобного COOH-концевого модуля. Для изучения структурных основ функционирования каталитического N-модуля проведено компьютерное моделирование его пространственной (3D) структуры. Модель структуры N- модуля TyrRS представляет собой нуклеотидсвязывающий фолд – свертку Россмана (RF), к которому присоединен α-спиральний домен (αHD). RF-домен формирует β-лист, содержащий пять параллельных и один антипараллельный β-стрэнды, окруженные α-спиралями. Соединительный полипептид, CP1, размещен между β3- и β4-cmpендами RF-домена. Анализ модели выявил консервативные элементы, способные формировать область связывания гомологичной tRNATyr . Эта область включает некоторые аминокислотные остатки CP1, например, функционально важные Lys146 и Lys147, которые были идентифицированы ранее методом сайт-направленного мутагенез

Органопротекция и предупреждение полиорганной недостаточности при чрескожном коронарном вмешательстве высокого риска в условиях экстракорпоральной мембранной оксигенации

Aim. To compare the possibilities of venoarterial extracorporeal membrane oxygenation (VA ECMO) and intra-aortic balloon pump (IABP) to prevent organ damage and the development of multiple organ failure.Methods. According to the inclusion and exclusion criteria, 51 patients underwent the study. The patients were divided into 2 groups depending on the method of mechanical circulatory support used: VA ECMO (n = 29) and IABP (n = 22). To assess organ functions in the intra- and postoperative period, the results of instrumental and laboratory research methods, as well as data from complex scales of organ dysfunction, were analased.Results. Myocardial depression was observed in the IABP group in the intraoperative period of high-risk percutaneous coronary intervention and worse hemodynamic stability compared to the VA ECMO group was traced. Organ dysfunction and multiorgan failure developed more often in the IABP group, which was confirmed by laboratory specific markers.Conclusion. High-risk percutaneous coronary intervention with VA ECMO is accompanied by a lower incidence and severity of organ damage and multiple organ failure. Thus, the VA ECMO has better organ protective effects. Цель. Сравнить возможности веноартериальной экстракорпоральной мембранной оксигенации (ВА ЭКМО) и внутриаортальной баллонной контрпульсации (ВАБК) предупреждать органное повреждение и развитие полиорганной недостаточности.Материалы и методы. Согласно критериям включения и исключения, в исследование вошел 51 пациент. В зависимости от используемого метода механической поддержки кровообращения больные разделены на две группы: ВА ЭКМО (n = 29) и ВАБК (n = 22). С целью оценки органных функций в интра- и послеоперационном периоде проанализированы результаты инструментальных и лабораторных методов исследования, а также данные комплексных шкал органной дисфункции.Результаты. В интраоперационном периоде чрескожного коронарного вмешательства высокого риска в группе ВАБК отмечены депрессия миокарда и худшая, в сравнении с ВА ЭКМО, гемодинамическая стабильность. Органная дисфункция и полиорганная недостаточность чаще развивались в группе ВАБК, что подтверждено лабораторными специфическими маркерами.Заключение. Чрескожное коронарное вмешательство высокого риска в условиях ВА ЭКМО сопровождается меньшими частотой развития и выраженностью органного повреждения и полиорганной недостаточности. Таким образом, ВА ЭКМО оказывает лучшее органопротективное действие.

Conformational flexibility of interdomain linker in bovine tyrosyl-tRNA synthetase studied by molecular dynamics simulation

Here we report a study of molecular dynamics of a YCD2 fragment of mammalian tyrosyl-tRNA synthethase (Asp322-Ser528), which includes the COOH-terminal cytokine-like domain, intermodular flexible linker, and H5-α-helix of catalytic core of synthetase. Our calculations show that while compact C-terminal domain was less flexible and relatively stable, the interdomain linker shows a high degree of conformational changes. After short relaxation time it forms a short helix-like structure, which may be involved in the regulation of domain interaction and modulation of protein activities.Здійснено дослідження молекулярної динаміки YCD2- фрагмен­та тирозил-тРНК синтетази ссавців (Asp322-Ser528), який включає СООН-кінцевий цитокінподібньїй модуль, міжмодульний гнучкий лінкер та Н5-α-спіраль каталітичного модуля синтетази. У процесі динаміки компактний С-кінцевий домен виявився менш рухливим і відносно стабільним, тоді як міжмодульний лінкер піддався значним конформаційним пере­будовам. Після короткого періоду релаксації у лінкері виявлено формування короткої спіральної ділянки, яка може бути причетною до регуляції взаємодії доменів і модуляції активно­стей білка.Описано исследование молекулярной динамики фрагмента YCD2 тирозил-тРНК синтетазы млекопитащих (Asp322-Ser528), включающего СООН-концевой цитокинподобный до­мен, межмодульный гибкий линкер и Н5-α-спираль каталити­ческого модуля синтетазы В процессе динамики компактный С-концевой домен белка оказался менее подвижным и относи­тельно стабильным, тогда как межмодульный линкер выявил значительные конформационные перестройки. После коротко­го периода релаксации обнаружено образование короткого спи­рального участка, который может быть вовлечен в регулиро­вание взаимодействия доменов и модуляции активностей бел­ка

Bacterial expression and isotope labeling of AIMP1/p43 codosome protein for structural studies by multidimensional NMR spectroscopy

AIMP1/p43 protein is a structural component of multisynthetase complex (codosome) in eukaryotes, which reveals both tRNA binding and cytokine activities. Aim. Bacterial expression and purification of isotopically-labeled recombinant AIMP1/p43 protein in E. coli cells for studying its solution structure by multidimensional NMR spectroscopy. Methods. AIMP1/p43 protein was expressed in E. coli BL21(DE3)pLysE cells on M9 minimal medium with 15N isotope labeling and purified by metal-chelated chromatography. Heteronuclear 2D 1H-15N NMR experiments were performed in solution at 293 K on Agilent DDR2 800 NMR spectrometer. Results. The AIMP1/p43 protein was obtained in uniformly 15N-labeled form as an NMR sample. A high dispersion of resonance signals in the 2D 1H-15N HSQC NMR spectra confirmed the presence of its compact 3D protein structure. The NMR spectrum of AIMP1/p43 demonstrated a high signal-to-noise ratio and sufficient stability to acquire other multidimensional NMR data sets for determination of the structure of AIMP1/p43 protein in solution. Conclusions. The 15N-labeled AIMP1/p43 protein was stable for 4–7 days, which makes possible acquiring the critical NMR experimental data for detailed structural analysis in solution. Our data on the initial NMR spectra indicated the presence of some additional signals in comparison with the NMR spectrum of EMAP II which could be assigned to amino acids of the N-terminal α-helical fragment of AIMP1/p43.AIMP1/p43 – структурний компонент мультисинтетазного комплексу (кодосома) евкаріот, проявляє тРНК зв’язуючу та цитокінову активність. Мета. Провести бактеріальну експресію та очистку ізотопно-міченого рекомбінантнога білка AIMP1/p43 в клітинах E. coli для вивчення його просторової структури методами мультивимірної ЯМР спектроскопії. Методи. AIMP1/p43 був експресованний в клітинах E. coli BL21 (DE3) pLysE на мінімальному середовищі М9 з міченням ізотопом 15N та очищено за допомогою метал-хелатуючої хроматографії. Гетероядерні двомірні 1H-15N ЯМР експерименти проводилися в розчині при температурі 293 К на ЯМР спектрометрі Agilent DDR2 800. Результати. Білок AIMP1/p43 був отриманий в 15N-міченій формі в якості ЯМР зразка. Висока дисперсія сигналів у двомірниї ЯМР спектрах 1H-15N HSQC підтверджує наявність компактної тривимірної структури білка. ЯМР спектр AIMP1/р43 виявляє значне співвідношення сигнал-шум та достатню стабільність, щоб застосувати інші багатовимірні ЯМР експерименти, для визначення структури AIMP1/p43 білка у розчині. Висновки. 15N-мічений білок AIMP1/p43 зберігає стабільність протягом 4–7 днів, що дає можливість подальшого отримання важливих ЯМР експериментів для проведення детального структурного аналізу білка у розчині. Наші дані первинного аналізу даних ЯМР вказують на присутність деяких додаткових сигналів у порівнянні зі спектрами ЯМР EMAP II, які можуть бути віднесені до амінокислот N-кінцевий α-спірального фрагмента AIMP1/р43.Белок AIMP1/p43 является структурным компонентом мультисинтетазного комплекса (кодосома) эукариот, проявляет тРНК связующую и цитокиновую активность. Цель. Провести бактериальную экспрессию и очистку изотопно-меченого рекомбинантного белка AIMP1/p43 в клетках E. coli, для изучения его пространственной структуры методами мультимерной ЯМР спектроскопии. Методы. AIMP1/p43 экспрессировали в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysE на минимальной среде М9 с мечением изотопом 15N и очистили с помощью металл-хелатирующий хроматографии. Гетероядерные двухмерные 1H-15N ЯМР эксперименты проводились в растворе при температуре 293 К на ЯМР спектрометре Agilent DDR2 800. Результаты. Белок AIMP1/p43 был получен в 15N-меченой форме в качестве ЯМР образца. Высокая дисперсия сигналов в двумерных ЯМР спектрах 1H-15N HSQC подтверждает наличие компактной трехмерной структуры белка. ЯМР спектр AIMP1/р43 показывает значительное соотношение сигнал-шум и достаточную стабильность, чтобы применить другие многомерные ЯМР эксперименты для определения структуры AIMP1/p43 белка в растворе. Выводы. 15N-меченый белок AIMP1/p43 сохраняет стабильность в течение 4–7 дней, что дает возможность дальнейшего получения важных ЯМР экспериментов для проведения детального структурного анализа белка в растворе. Наши данные первичного анализа данных ЯМР указывают на присутствие некоторых дополнительных сигналов в сравнении со спектрами ЯМР EMAP II, которые могут быть отнесены к аминокислот N-концевой ?-спирального фрагмента AIMP1/р43

Synthesis and characterization of fluorogenic peptide substrate of HIV-1 protease based on fluorescence resonance energy transfer

Synthesis of fluorogenic peptide substrate of HIV-I protease Dns-SQNYPIVWL which corresponds to the p17/p24 cleavage site for HIV-l protease have been performed. This fluorogenic substrate was based on the fluorescence resonance energy transfer between donor – Trp residue, and acceptor – dansyl group in the intact peptide. Hydrolysis of substrate by recombinant HIV-I protease resulted in the time-dependent increase of Trp fluorescence and decrease of dansyl fluorescence measured at 350 and 500 nm, respectively, due to the break of resonance energy transfer between donor and acceptor fluorophors. Hydrolysis of fluorogenic peptide substrate was studied also by reversed phase HPLC and two peptide fragments after cleavage of substrate have been detected. Kinetic constants of hydrolysis for this fluorogenic peptide substrate by HIV-I protease were calculated from Lineweaver – Burk plots: KM - 29mkM, kcat =5.4 s⁻¹ and kcat / KM -180000 M⁻¹s⁻¹.Проведено хімічний синтез флюорогенного пептидного субстрату ВІЛ-1 протеази, що має структуру Dns-SQNYPIVWL і відповідає сайту розщеплення р17/р24 у gag-поліпротеіні вірусу імунодефіциту людини.Принцип використання даного субстрату базується на резонансному переносі енергії збудження між донором – залишком Trp і акцептором – дансильною групою. Встановлено, що гідроліз флюорогенного пептидного субстрату рекомбінантною ВІЛ-1 протеа­зою призводить до падіння інтенсивності флюоресценції дансильної групи і одночасного зростання триптофанової флюоресценції внаслідок порушення резонансного переносу енергії між донором і акцептором. За допомогою високоефективної рідинної хроматографії в оберненій фазі зафіксовано появу пептидів, які є продуктами гідролізу субстрату. Визначено кінетичні параметри гідролізу флюорогенного пептидного субстрату ВІЛ-1 протеазою: КМ – 29 мкМ, kcat– 5,4 с⁻¹ та kcat/KM – 180 000 M⁻¹c⁻¹.Проведен химический синтез флюорогенного пептидной субстрата ВИЧ -1 протеазы , имеющей структуру Dns – SQNYPIVWL и соответсвует сайтурасщепления р17/р24 в gag – полипротеини вируса иммунодефицита людини. Принцип использования данного субстрата базируется на резонансном переносе энергии возбуждения между донором - остатком Trp и акцептором – дансильною группой. Установлено, что гидролиз флюорогенного пептидной субстрата рекомбинантной ВИЧ -1 протеазой приводит к падению интенсивности флюоресценции дансильнои группы и одновременного роста триптофановой флюоресценции вследствие нарушения резонансного переноса энергии между донором и акцептором. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обратной фазе зафиксировано появление пептидов, которые являются продуктами гидролиза субстрата. Определены кинетические параметры гидролиза флюорогенного пептидной субстрата ВИЧ -1 протеазой : КМ – 29 мкм , kcat - 5,4 с ⁻¹ и kcat / KM – 180 000 M⁻¹c ⁻¹